二、项目方案：
1、项目研究背景（国内外的研究现状及研究意义、项目已有的基础，与本项目有关的研究积累和已取得的成绩，已具备的条件，尚缺少的条件及方法等）
1.1国内外的研究现状及研究意义
真菌广泛分布于自然界，种类繁多、数量庞大。真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，由于真菌的生物学特性，它污染的对象主要是潮湿的或半干燥的贮藏食品，谷物污染尤为严重。真菌毒素的污染是食品安全领域内较为突出的问题之一，据联合国粮食与农业组织（FAO）报告，全球约有25%的农作物遭受真菌及其毒素污染，约有2%的农作物因污染严重而失去营养和经济价值，由此而造成的直接及间接损失可能达到数百亿美元。目前已知有300多种不同的真菌毒素。对人类危害严重的真菌毒素主要有十几种，其中包括黄曲霉毒素B1 (Aflatoxin B1，AFB1)、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮 (Zearalenone， ZEN或F-2)、桔霉素、展青霉毒素等，其中AFB1、OTA、DON和ZEN是几种最为常见的真菌毒素，也是我国粮食质检部门必须监控的真菌毒素。全世界每年因真菌毒素造成的经济损失巨大。
免疫层析试纸条（Immunochromatographic assay，ICA）是一种利用分子在硝酸纤维素膜中的流动性，基于抗原抗体免疫反应，建立的一种利用胶体金的光学性质可肉眼观测检测结果的方法。ICA在快速检测中的优势明显：简单快速、不需要大型仪器设备、不需要专业的操作人员、低成本、不受检测地点限制等。ICA方法近年来发展迅速，已成为农业和医学现场快速检测中最常用的方法之一。免疫层析试纸条在结构上主要由以下四部分组成：NC膜、结合垫、样品垫以及吸水垫，结构图如图1.1所示。ICA常见的免疫分析形式有：双抗夹心法，主要利用结合抗原不同位点的两类抗体检测大分子抗原；竞争法，主要适用于小分子免疫分析，与天然抗原竞争结合抗体；间接法则常用于检测抗体。赵红艳等研制的基于抗F-2单克隆抗体的快速检测F-2的胶体金试纸条，该方法的检测限可达30 µg/kg。Duan等利用CdSe/ZnS量子点封装合成量子点微球，且用于制备荧光探针，建立了检测F-2毒素的荧光免疫层析试纸条，在无基质溶液和玉米样品中F-2的检出限分别为0.0625 ng/mL和3.6 µg/kg。Tang等以增强荧光的新型Eu / Tb（III）纳米球作为荧光信号，并与抗F-2独特型纳米抗体偶联，开发了一种基于抗独特型纳米抗体的时间分辨荧光免疫色谱法，用于快速定量和同时检测玉米及其产品中的AFB1和F-2，检测线性范围分别为0.13~4.54和0.20~2.77 ng/mL, 最低检测线分别为0.05和0.07 ng/mL，加标样本回收率为72.6%-106.6%。
图1.1 免疫层析试纸条基本结构示意图
Fig 1.1 The basic construction of ICA
真菌毒素分析检测方法主要基于竞争免疫分析模式，全抗原的合成与制备尤其重要，且主要依赖于化学合成手段，然而化学合成过程中使用的有毒标准品及试剂，会对人的身体健康及环境安全造成潜在的危害；此外，化学合成抗原的制备存在着合成步骤繁琐、反应时间长、副产物多、批次误差大等缺陷在某种程度上影响了化学合成抗原及检测技术在实际生产中的应用。因此，越来越多的研究人员开始改进传统抗原的制备方法，研制真菌毒素的替代物，并开发了基于真菌毒素不同类型抗原模拟物的绿色免疫分析方法。抗原模拟物的研究主要是基于噬菌体展示多肽（Phage displayed peptide）和抗独特型抗体（Anti-idiotype antiboies，AId），并可利用体外重组技术进一步对抗原模拟物进行免疫性能和应用分析。
抗原噬菌体多肽模拟表位的获取方法主要是以相应抗体作为靶标分子，投入噬菌体展示的随机多肽库，进而淘选出可模拟天然抗原与抗体特异性结合的噬菌体克隆，经DNA测序分析后即可获得该抗原的噬菌体多肽模拟表位。在真菌毒素免疫分析中，噬菌体多肽模拟表位可以作为传统化学合成抗原的替代物直接应用于它们的免疫学检测分析，且可显著提高免疫分析灵敏度。余娟等以DON单抗为靶分子，从噬菌体展示的环七肽库中淘选到两个不同氨基酸序列的DON多肽模拟表位，并建立了基于噬菌体模拟表位的间接竞争ELISA方法，其最大半抑制浓度IC50为 0.058 g/mL。贺贞云等从噬菌体展示十二肽库和环七肽库中淘选OTA模拟表位，在保守序列FQLH的两端分别引入3个随机的氨基酸残基，首次构建噬菌体展示二级肽库，经phage-ELISA鉴定，噬菌体展示的OTA模拟表位IC50由一级库的0.50-1.03 ng/mL提高至0.052-0.336 ng/mL。
由于以噬菌体形式存在的模拟表位在免疫分析中的稳定性较差、保存条件严格且易污染操作环境，噬菌体模拟表位应用受到一定的限制。解决方式如下：在获得模拟表位（展示多肽）的氨基酸组成信息后，一是通过化学合成多肽，再将其与大分子蛋白质进行偶联，从而替代小分子全抗原；二是利用分子生物学手段将多肽与分子伴侣在原核表达系统中进行融合表达，实现小分子物质全抗原的生物合成。何庆华将F-2的十二肽模拟表位的编码基因克隆至pMAL-pⅢ 载体中，转化至大肠杆菌中进行原核表达，获得了F-2的生物合成全抗原并应用于免疫分析。Peltomaa等采用噬菌体展示多肽技术淘选得到针对FB1多肽模拟表位，并进一步于黄色荧光蛋白（YFP）进行融合表达，建立了检测FB1的纳米金淬灭融合蛋白黄色荧光的均相免疫方法。
抗独特型抗体（AId）是根据抗体分子上的独特型抗原决定簇，在异种或同种异体以及自身体内诱导产生相应的抗体。抗独特型抗体已被证明可用于模拟天然抗原与相应抗体之间特异性结合，因此可作为传统化学合成抗原的替代物。β型AId可识别抗体的抗原结合位点，且三维构象与天然抗原类似，可以完全阻断天然抗原与抗体的特异性结合，可作为小分子抗原模拟物，其可通过淘选噬菌体展示抗体库来获得。噬菌体抗体库技术是将抗体的重链、轻链可变区基因插入至噬菌体膜蛋白基因 Ⅲ 或基因Ⅷ 的信号编码区下游，以展示在外壳蛋白Ⅲ 或Ⅷ 的N端。通过构建噬菌体展示纳米抗体库获得的抗独特型纳米抗体可与抗体特异性结合，并应用于免疫学分析。Wang等从噬菌体展示纳米抗体库中淘选得到的抗独特型纳米抗体用作F-2的无毒替代品，开发了检测F-2的绿色无毒Phage-ELISA方法，该方法的IC50为0.25 ng/mL，线性范围为0.11-0.55 ng/mL，F-2毒素的PD-IPCR的检出限为6.5 pg/mL。Shu等制备的抗FB1独特型纳米抗体−碱性磷酸酶融合蛋白（Ab2−Nb−AP）保留了良好的碱性磷酸酶活性和抗体结合能力，并以其作为酶标抗原，建立了检测谷物中FB1的直接竞争一步ELISA，该方法的IC50为2.69±0.25 ng/mL，线性范围0.93-7.73 ng/mL，最低检测限（LOD）为0.35 ng/mL。
本项目拟利用生物合成抗原生产成本低、操作简便、无批次误差的特点应用在T线上，作为人工抗原的替代品，以QDs/QBs作为信号输出元件，建立基于生物合成抗原Peptide-MBP的三重荧光免疫层析试纸条(multiplex fluorescent immunochromatographic assay, mFICA），可在裸眼条件下实现对食品中的真菌毒素FB1、F-2和OTA快速检测分析。
1.2项目已有的基础
本项目指导老师所在实验室在小分子物质的模拟抗原方向已开展了大量的前期研究，目前已经获得了几种真菌毒素的噬菌体展示模拟表位(七肽、环七肽、十二肽)，将模拟表位与MBP 蛋白进行了融合表达，建立了基于模拟表位的Phage-ELISA及基于融合蛋白的ELISA体系。以这些模拟抗原建立的间接竞争ELISA方法的灵敏度比以人工合成抗原所建立的ELISA的提高了3-20 倍左右。AFB1和FB1海胆状胶体金免疫层析试纸条也开发成功。同时本实验室已经拥有项目研究所需的真菌毒素单克隆抗体、表达载体、宿主等重要实验材料，因此保证了技术储备及人员操作技能。
1.3 与本项目有关的研究积累和已取得的成绩，已具备的条件，尚缺少的条件及方法等
本项目指导老师所在课题组经过国家十五重大科技专项、863课题、973课题、国家自然科学基金等项目的资助，已在真菌毒素的免疫学检测方面搭建了良好的技术平台，不仅制备了常见真菌毒素的单克隆抗体，而且利用随机肽作为检测抗原建立了无毒免疫分析方法，从噬菌体展示肽库和环肽库中筛选到了FB1、F-2和OTA的模拟抗原。已开展了食品中常见真菌毒素酶联免疫分析、胶体金免疫层析、化学发光免疫检测、电化学免疫及膜基质蛋白质芯片等研究工作，部分研究成果详见下列发表论文及专利。
(1) Xu Y., Yang H., Huang Z., Li Y., He Q., Tu Z., Ji Y., Ren W. A peptide/maltose-binding protein fusion protein used to replace the traditional antigen for immunological detection of deoxynivalenol in food and feed. Food Chem, 2018. 268: 242-248
(2) Ren W.J., Huang Z.B., Xu Y., Li Y.P., Ji Y.W., Su B.W. Urchin-like gold nanoparticle-based immunochromatographic strip test for rapid detection of fumonisin B1 in grains. Anal Bioanal Chem, 2015 ,407(24):7341-8.
(3) Ji Y.W., Ren M.L., Li Y.P., Huang Z.B., Shu M., Yang H.W., Xiong Y.H., Xu Y. Detection of afl atoxin B1 with immunochromatographic test strips: Enhanced signal sensitivity using gold nanoflower. Talanta, 2015, 142: 206–212
(4) He Q.H., Xu Y., Zhang C.Z., Li Y.P., Huang Z.B. Phage-borne peptidomimetics as immunochemical reagent in dot-immunoassay for mycotoxin zearalenone. Food Control, 2014, 39:56-61.
(5) He Q.H., Xu Y., Wang D., Kang M., Huang Z.B., Li Y.P. Simultaneous multiresidue determination of mycotoxins in cereal samples by polyvinylidene fluoride membrane based dot immunoassay. Food Chem, 2012,134: 507-512.
(6) He Q.H., Xu Y., Huang Y.H., Liu R.R., Huang Z.B., Li Y.P. Phage displayed peptides that mimic zearalenone and its application in immunoassay. Food Chem, 2011, 126(3): 1312-1315.
(7) Xu Y., Huang Z.B., He Q.H., Deng S.Z., Li L.S., Li Y.P. Development of an immunochromatographic strip test for the rapid detection of deoxynivalenol in wheat and maize. Food Chem, 2010, 119 (2): 834-839.
(8) 何庆华，许杨. 一种针对伏马菌素B1的十二肽抗原模拟表位及其应用，发明专利号：ZL201410529689.7。（已授权）
(9) 何庆华，许杨.赭曲霉毒素A的十二抗原肽库模拟表位及其应用;ZL201410549424.3（已授权）
本项目指导老师所在的课题组所依托的食品科学与技术国家重点实验室和南昌大学中德联合研究院拥有现代化的实验设备，其中包括：BioDot 胶体金划膜和喷金机、Agilent 液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱、ForteBio BLItz 单样本分子相互作用分析仪、圆二色谱仪、全自动酶标仪、全自动免疫化学发光仪、荧光分光光度计、紫外可见分光光度计、生物凝胶成像系统、AKTA 蛋白纯化系统、毛细管电泳仪、核酸/蛋白分析仪、高效液相色谱仪、气相色谱仪、超速冷冻离心机、高速冷冻离心机、Millipore 超纯水系统、电转仪等。因此从实验条件来讲，可满足本项目的要求。
2、项目研究目标及主要内容
2.1项目研究目标
拟利用原核表达系统合成FB1、F-2和OTA的模拟抗原，将它们应用在T线上，作为人工抗原的替代品，以QDs/QBs作为信号输出元件，建立基于生物合成抗原Peptide-MBP的三重荧光免疫层析试纸条，实现可在裸眼条件下对食品中的真菌毒素FB1、F-2和OTA快速检测分析。
2.2 主要内容
2.2.1 FB1、F-2和OTA模拟抗原的表达及纯化
设计引物分别扩增FB1、F-2和OTA模拟抗原基因，分别克隆到含MBP的pMAL-pⅢ载体中，优化融合蛋白表达条件，采用亲和层析法分离融合蛋白，并确定蛋白浓度，12% SDS-PAGE验证抗原表达情况，并用ELISA分别验证其生物活性。
2.2.2 抗FB1、F-2和OTA单克隆抗体的制备
复苏抗FB1、F-2和OTA单克隆抗体的杂交瘤细胞，腹腔注射小鼠，收集腹水，protein G柱纯化单克隆抗体，SDS-PAGE验证抗体纯化效果，并用ELISA分别验证其生物活性。
2.2.3 胶体金免疫层析试纸条的研制
主要包括荧光量子点-抗体标记物的制备、结合物释放垫的包被、硝酸纤维素膜的包被和免疫试纸条的组装等步骤，并对各个步骤进行优化；对免疫层析试纸条各种影响因素（缓冲体系、胶体金粒度、硝酸纤维素膜的种类、抗原和抗体浓度等）进行优化。
2.2.3.1 试纸条的组装
将硝酸纤维素膜（NC膜, CN140）、吸水垫、结合垫以及样品垫，按照试纸条结构原理，分别组装粘贴至底板上；利用胶体金点膜仪将F15-MBP、Z15-MBP、L12-206及羊抗鼠二抗分别喷涂至NC膜上作为检测线（T线）和质控线（C线），用试纸条切割机切割成试纸条。
2.2.3.2 荧光探针的制备
采用一步法将羧基化修饰的水溶性绿色量子点与L12-206偶联合成QDs-MPAQDs528-OTA mAb探针，采用两步法将红色或黄色水溶性羧基化荧光微球分别与F15-MBP、Z15-MBP偶联合成QBs640-FB1 mAb及QBs580-F-2 mAb探针。
2.2.3.3 荧光试纸条检测性能的评估
确定荧光试纸条最低可视检测限；确定试纸条的特异性、准确性、灵敏度、试纸条的稳定性。
2.2.4 试纸条的确证与实际样品的检测
采用制备的荧光量子点免疫层析试纸条对谷物进行现场检测，并采用HPLC和LC-MS等仪器方法进行确证实验。
3、项目创新特色概述
侧向流免疫层析试纸条是世界各国日益兴起的用于现场实时检测的重要手段，在现场快速和实时分析中发挥着重要作用。近几年来，特别是基于小分子免疫分析检测，在以往试纸条的开发过程中，无论是单一检测还是多重检测，竞争抗原的化学合成制备过程中存在着合成步骤繁琐、制备时间长、对操作人员技术要求高、副产物多、批次误差大等诸多不利因素。
本课题是根据我国食品安全的现状，结合指导老师所在团队在真菌毒素研究方面的特色和优势，针对可能获得突破的关键科学问题而提出的。其创新性主要体现在：
（1）研究目标的创新。本项目拟解决的关键科学问题是大力发展无需使用毒素的绿色免疫分析技术，该技术可面向基层、检测灵敏度有望提高的现场快速检测技术。这个科学问题，是政府部门、食品安全研究机构、食品企业等各单位共同关心的基本问题。
（2）研究思路的创新。模拟真菌毒素的随机多肽与蛋白偶联表达后形成有效的构象，再结合荧光量子点的放大信号，从而研制灵敏度更高的多重残留免疫层析试纸条。
5、研究进度安排
研究进度安排如下：
2020.7-2020.12
研究计划：抗OTA、FB1、F-2单克隆抗体杂交瘤细胞复苏、单抗制备及活性测定；
2021.1-2021.3
研究计划： OTA、FB1、F-2的模拟抗原的融合表达载体构建；
2021.4-2021.6
研究计划： OTA、FB1、F-2的模拟抗原纯化及活性测定。
2021.7-2021.9
研究计划：优化量子点荧光免疫层析试纸条的影响因素（缓冲体系、模拟抗原）；
2021.10-2021.12
研究计划：优化量子点荧光免疫层析试纸条的影响因素（缓抗体浓度、标记条件等）；试纸条的组装；
2022.1-2022.3
研究计划：确定试纸条的特异性、准确性、灵敏度、稳定性；
2022.4-2022.6
研究计划：样品检测及确证实验（HPLC、LC-MS）。
6、项目组成员分工
彭天浩，项目负责人，负责单抗制备及活性测定
柴嘉欣，负责模拟抗原的融合表达载体构建及蛋白纯化
王嘉怡，负责荧光试纸条参数的优化
蒋子涵，负责荧光试纸条检测性能评估