二、项目方案：
1、项目研究背景（国内外的研究现状及研究意义、项目已有的基础，与本项目有关的研究积累和已取得的成绩，已具备的条件，尚缺少的条件及方法等）
1.1国内外的研究现状及研究意义
重金属铅（lead, Pb）、镉（cadmium, Cd）、砷（arsenic, As）和汞（mercury, Hg）广泛存在于人类赖以生存的环境中，同时它们也是世界卫生组织公布的公共卫生领域所关注的十大主要化学物中仅有的四种重金属[1]，且是一般人群血液中能检测到的典型神经毒物[2]。暴露于其中的某一单个重金属对人体的危害已被广泛研究，且发现对神经系统学习和记忆等发育障碍损伤作用尤为明显[3-6]。然而，人类暴露环境化学物质最明显的特点是暴露于其混合物中[7]。目前，已有少量研究涉及铅、镉、砷、汞中的两种或三种重金属联合暴露[8-11]。但是，这些研究没有涉及未观察到有害作用水平（no observed adverse effect levels, NOAELs）或低于NOAELs的重金属混合物的联合作用效果。换而言之，两种或两种以上低于NOAELs的重金属联合暴露是否会产生有害效应尚不知晓[12]。此外，铅、镉、砷、汞四种重金属联合暴露对神经系统影响的研究也未见报道。
项目团队前期在体外培养的不同神经细胞上通过析因实验探索铅、镉、砷和汞四种重金属在其混合物中的交互作用特点，发现当单个重金属暴露浓度低于未观察到有害作用水平（NOAELs）的一般人群血液负荷[Pb: 0.05 μM (9.73 μg/L), Cd: 0.0025 μM (0.279 μg/L), As: 0.015 μM (1μg/L), and Hg: 0.0035 μM (0.703 μg/L), 1 ×MM]及其相关水平（5×MM和10×MM）时，四种重金属联合暴露可产生新的不同于两种或三种重金属的协同细胞毒性损伤[13]。因此，选择一般人群血液负荷及其相关水平作为暴露剂量、四种重金属联合暴露作为暴露模式，在整体动物和细胞水平进行重金属神经发育障碍及其机制研究。动物实验中验证了一般人群负荷相关水平四金属联合暴露可浓度依赖性地引起大鼠神经系统神经发育损伤。细胞水平的深入机制研究揭示，四金属联合暴露可通过激活血清诱导激酶（serum-induced kinase, Snk）-树突棘相关的Rap三磷酸鸟苷酶激活蛋白（Spine-associated Rap GTPase-activating protein, SPAR）通路引起神经细胞树突棘密度和形态等树突棘结构损害进而导致神经发育障碍[13-15]。
作为树突棘自我动态平衡的主要机制，Snk-SPAR通路在支撑维持树突棘形态及其突触链接中起重要作用。该通路主要表现为神经元活动过度激活的Snk使SPAR磷酸化，泛素连接酶（Ub）能识别磷酸化的SPAR并对其泛素化，然后通过蛋白酶体通道降解SPAR，从而导致树突棘结构的重排和突触的不稳定连接[16]。此外，最新研究发现，脑组织发育期表达丰富的神经营养因子胰岛素样生长因子1（Insulin-like Growth Factor 1, IGF-1）可以通过调节周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase-like 5, CDK5)进而逆转过度激活的Snk-SPAR引起的树突棘损伤[17-18]。IGF-1和CDK5是否也参与了重金属联合暴露致树突棘神经发育障碍也值得进一步研究。Snk-SPAR通路及其上游调节蛋白IGF-1和CDK5均可能是重金属污染所致神经发育障碍中的作用靶点。
研究证实，小分子多酚类化合物（polyphenols），作为一种广泛存在于植物体内具有多个酚羟基的次生代谢产物，具有很好的神经保护和神经发育作用。常见小分子多酚类化合物包括葡萄多酚、茶多酚、苹果多酚和黄酮类等。白藜芦醇（resveratrol）作为葡萄多酚中一种很重要活性物质，主要存于葡萄、花生、虎杖等植物中，尤其在新鲜的葡萄皮中含量最高。大量实验证实白藜芦醇是红葡萄酒中发挥神经保护作用的主要物质[19-20]。白藜芦醇可以通过调节海马树突棘形态来改善糖尿病和慢性脑缺血大鼠认知损伤[21-22]。本实验室前期研究也发现白藜芦醇可以逆转重金属铅暴露所致的大鼠学习记忆损伤[23]。茶多酚最主要成分为儿茶素类化合物，约占茶多酚总量的70％~80％，其中又以活性物质表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)含量最高，且具有清除多种自由基的作用。体内与体外研究均表明EGCG可调节海马树突棘形态而起到神经元保护作用[24-25]。此外，黄酮类成分槲皮素和姜黄素等小分子多酚类化合物也被发现可以通过抗氧化和抗炎症活性等多途径保护突触和促进神经发生进而起到神经保护作用[26-27]。那么，小分子多酚是否对低剂量铅、镉、砷和汞四种重金属联合暴露所引起的神经发育障碍及树突棘损害存在干预作用呢？其干预作用是否会通过Snk-SPAR通路及其上游调节蛋白IGF-1和CDK5呢？目前均尚不清楚。
因此，在前期工作基础上，本项目采用神经行为功能检测、共聚焦显微技术、膜片钳电生理系统、透射电子显微镜技术、活细胞成像树突棘动态观察法和高尔基染色等技术，在整体动物和细胞水平上，明确小分子多酚对重金属铅、镉、砷和汞联合暴露所致神经发育障碍及树突棘损害的干预作用。同时，分别在细胞上采用质粒构建和转染技术、动物上采用脑立体定位微量注射技术，进一步深入探讨树突棘相关Snk-SPAR通路及其上游调节蛋白IGF-1和CDK5在小分子多酚干预重金属联合暴露所致神经发育障碍的分子机制。以上研究结果将为神经发育保护提供新的策略和手段，同时为开发防治环境重金属污染所致神经系统疾病的药食同源产品提供新思路。
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1.2项目已有的基础
（1）项目课题组长期从事环境重金属及其联合暴露对神经系统的影响研究。指导老师主持和参与国家自然科学基金项目“CIB1调控树突棘消长泛素化/磷酸化双通路在低剂量重金属联合暴露致神经行为异常的分子机制”、“低剂量重金属联合暴露的神经元树突棘异常及其LIMK1/SSH1分子调控机制”、“SIRT1/ERK变构修饰控制突触生长的MEF2在铅暴露所致学习记忆损害分子机制中的作用”；参与完成国家自然科学基金项目“重金属环境下神经突触稳态及其分子机制”，“RyRs调控细胞内钙信号介导突触可塑在铅所致神经发育障碍中的作用”，“沉默因子NRSF对环境重金属铅作用下突触异常关键蛋白的调控机制”。并在SCI期刊杂志上发表相关文章26篇，其中以第一作者或共同第一作者在J Hazard Mater （IF=9.038）、Environ Int (IF=7.577)等1区TOP期刊上发表SCI论文8篇。
（2）已发表和待发表与本项目直接有关的主要结果：
1) 重金属铅、镉、砷和汞联合暴露致神经发育障碍及其Snk-SPAR通路机制。
本团队前期主要是基于整体动物和体外培养神经细胞模型，探讨重金属铅、镉、砷和汞联合暴露致神经行为神经发育障碍及其机制。在整体动物实验中，采用行为功能检测发现了四种金属在一般人群体内负荷及相关水平上联合暴露后可浓度依赖性地引起大鼠感知能力和学习记忆损伤（图1），动物相关研究成果已发表在Environ Int. 2019, 133: 105192（中科院1区，IF 7.577）和J Hazard Mater. 2020, 388: 122081（中科院1区，IF9.038）。在细胞水平上，通过鬼笔环肽染色、共聚焦显微镜、免疫荧光以及质粒转染技术进行机制研究发现，四金属联合暴露可通过激活Snk-SPAR通路引起神经细胞树突棘损害进而导致神经发育障碍。细胞实验结果已发表在Ecotoxicol Environ Saf. 2018, 163: 674-684（中科院1区，IF 4.872）。本项目是对以上研究基础的延伸扩展，进一步探讨小分子多酚对重金属致神经发育障碍的干预作用及其分析机制。
图1 四金属联合暴露所致仔鼠学习记忆和感知觉能力浓度依赖性损伤
（A）空间感知觉能力悬崖回避试验；（B）非空间感知觉能力甩尾试验；（C）空间运动能力负趋地性试验；（D）非空间运动能力觉平面翻正试验；（E）非空间学习记忆能力避暗试验；（F）空间学习记忆能力水迷宫试验。注：“*”和“**”分别表示与Control组相比，P＜0.05和P＜0.01。
2) 细胞水平发现部分小分子多酚改善重金属联合暴露致树突棘损害作用。
在本项目进行的前期实验中，我们使用小分子多酚中的白藜芦醇对重金属联合暴露所致的神经损伤进行干预，F-actin染色结果发现白藜芦醇可以改善四金属联合暴露引起的树突棘损害（图2）。此外，我们还初步观察到白藜芦醇对四金属联合暴露引起的Snk-SPAR通路改变存在干预作用（图3），该结果还亟待进一步深入研究。总体而言，这些前期实验结果坚定了本项目假设的可行性，为其后续在细胞实验和动物模型上展开的小分子多酚改善重金属联合暴露致神经发育障碍及机制的顺利研究提供有力的基础保障。
1.3与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
申请团队长期研究重金属铅的神经毒性机制及可能的干预措施。主要研究成果包括：① 在动物和细胞模型上均证实铅暴露可通过降低细胞铁转出蛋白膜铁转运蛋白1（FP1）表达水平导致神经细胞内铁聚积造成氧化损伤进而引起神经功能障碍。相关研究成果发表于Toxicology 2019; 411: 101-109（IF: 4.099），Toxicology in Vitro 2014, 28(8): 1339-1348（IF: 2.959）和Toxicology Letters 2013, 216(2-3): 108-123（IF: 3.569）。② 研究还发现铅暴露可通过兰尼碱受体（RyRs）调节细胞内质网钙释放而引起胞内钙超载最终导致神经损伤，而营养素蛋氨酸和胆碱可逆转铅暴露所引起的这一系列损伤。相关研究成果发表于Sci Total Environ 2020, 701:134901（IF: 6.551）和Toxicology in Vitro 2013, 27(1): 387-395（IF: 2.959）。③ 此外，亦发现白藜芦醇可改善铅所致大鼠海马组织学习记忆“分子开关”环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）及其相关通路的损伤，相关研究成果发表于Environmental Toxicology and Pharmacology 2016, 44: 84-92（IF: 3.292）。以及饮食营养素在神经系统疾病儿童多动症中作用，相关研究成果发表于Nutrients, 2016; 8(6): 352.（IF: 4.546）。以上研究工作积累和已取得的研究工作成绩均与本项目研究内容相关，项目团队在环境污染物重金属暴露动物和细胞模型建立、重金属致神经损伤机制及其干预措施等方面积累了大量的经验，可为本项目的研究提供借鉴。
1.4 已具备的条件，尚缺少的条件及方法
南昌大学建有食品科学和工程国家重点实验室和江西省预防医学重点实验室，为开放实验室，实验室装备有一流的实验仪器和设备，足以满足本项目需要。此外，南昌大学建有实验动物科学中心，可满足本项目动物模型实验所需。
主要仪器设备包括：
1）冷链及分离设备：-86℃ 超低温冰箱(DW-HL388，中科美菱)，-20℃低温冰箱（BC/BD-326G，海尔集团），液氮生物储存器。冷冻高速离心机（LEGEND MICRO 17R，美国Thermo Fisher公司），超速离心机（XPN-80，美国Thermo Fisher公司）。
2）细胞培养装置：细胞培养室，超净工作台，细胞培养箱（Heraeus BB15，美国Thermo Fisher公司），倒置显微镜（CKX51，日本Olympus公司）。
3）分子生物实验用仪器：电泳/转膜槽（Mini-PROTEIN Tetra System，美国BioRad公司），PCR扩增仪（S1000，美国Bio-Rad公司），电子分析天平（BS 124S，北京赛多利斯科学仪器有限公司），化学发光凝胶成像系统（ChemiDoxTM XRS+，美国Bio-Rad公司），实时定量PCR，流式细胞仪（Cell Lab QuantaTM SC，美国Beckman-Coulter公司），荧光倒置显微镜（IX73，日本 Olympus 公司），激光共聚焦显微镜（LMS710，德国CARL ZEISS JENA 公司），全波段多功能酶标仪（EnSpire，美国PerkinElmer公司）。
4)生物化学用仪器：电感耦合等离子体质谱仪（7700x，美国 Agilent Technologies公司），原子荧光光度计（AFS-8330，北京吉天仪器有限公司），全自动生化分析仪（日立7020型，日本株式会社日立高新技术）。
5）电生理用仪器：电生理检测系统（Multiclamp 700B，美国Molecular Devices公司）。
2、项目研究目标及主要内容
2.1 研究目标：
在前期研究发现铅、镉、砷和汞低剂量联合暴露导致神经发育障碍的基础上，从整体动物、细胞和分子水平进一步探索小分子多酚对重金属联合暴露所致神经发育障碍和树突棘损害的干预作用及其分子机制。通过上述研究，为防治环境重金属污染所致树突棘损害相关的神经系统疾病开辟新思路。
2.2 研究内容：
（1）采用神经行为功能检测、HE染色以及CCK-8细胞活力检测，在具有实际意义的范围内探索小分子多酚的干预剂量，然后在整体动物和细胞水平上，明确小分子多酚对重金属铅、镉、砷和汞联合暴露所致神经发育障碍的干预作用。
（2）采用共聚焦显微技术、膜片钳电生理系统、透射电子显微镜技术、活细胞成像树突棘动态观察法、高尔基染色方法，在整体动物和细胞水平上，明确小分子多酚对重金属联合暴露所致树突棘损害的干预作用。
（3）采用免疫荧光技术、Real-time PCR、Western blot，探索Snk-SPAR通路及其上游调节蛋白IGF-1和CDK5在小分子多酚对重金属联合暴露所致树突棘损害及神经发育障碍干预作用的可能分子机制。
（4）采用质粒构建和细胞脂质体转染技术，在细胞模型上明确小分子多酚干预重金属联合暴露所致树突棘损害的分子机制。
（5）采用大鼠脑立体定位技术，在动物模型海马特定区域微量注射Snk-SPAR的抑制剂或激动剂以及重组胰岛素样生长因子1（IGF-1），并观察其神经发育行为功能和树突棘改变。从而在整体动物上明确小分子多酚干预重金属联合暴露所致神经发育障碍的分子机制。
2.3 拟解决的关键科学问题：
（1）明确小分子多酚对重金属联合暴露所致神经发育障碍的干预作用。
（2）明确小分子多酚干预重金属联合暴露所致神经发育障碍的分子机制。
3、项目创新特色概述
（1）本项目特色：环境重金属污染与健康关系是当今国内外研究的热点问题，而现实环境中以多种重金属污染共存为特点。本项目在重金属联合暴露引起神经发育障碍的基础上，研究小分子多酚的干预作用，对重金属污染所致神经系统疾病的防治具有现实指导意义。
（2）本项目创新：本项目先确定小分子多酚对重金属联合暴露所致神经发育障碍和树突棘损害的干预作用，随后针对树突棘相关的通路Snk-SPAR及其上游调节蛋白IGF-1和CDK5进行深入机制研究。这些研究到目前为止国内外未见报道。
4、项目研究技术路线
4.1在细胞模型上探讨小分子多酚在重金属联合暴露致神经损伤中的干预作用及分子机制
（1）神经细胞毒性分析：CCK-8检测细胞活力。
（2）神经发育相关树突棘结构分析：鬼笔环肽（F-actin）染色分析海马神经元树突棘密度和形态；活细胞成像观察树突棘动态变化；透射电子显微镜观察神经元超微结构突触后致密质（PSD）形态参数。
（3）树突棘相关通路表达分析：qPCR检测海马神经元Snk-SPAR通路及其上游调节蛋白IGF-1和CDK5基因表达水平；免疫蛋白印迹（WB）和免疫荧光法（IF）检测海马神经元树突棘通路相关蛋白表达水平及空间定位情况。详细步骤同动物实验。
（4）质粒构建和细胞转染后进行机制分析：构建树突棘关键通路基因Snk、SPAR、CDK5和IGF-1的过表达和低表达质粒，经细胞转染实现通路基因过表达或低表达后，观察神经毒性、树突棘等指标改变。
4.2 在整体动物模型上探讨小分子多酚对重金属联合暴露所致神经发育障碍的干预作用及其分子机制
（1）神经毒性分析：电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定全血和脑组织中重金属铅、镉、砷和汞的含量；HE染色分析脑组织病理改变。
（2）神经发育障碍分析：通过一系列神经行为功能试验包括，水迷宫试验和避暗试验检测仔鼠学习记忆能力；悬崖回避试验和甩尾试验检测仔鼠感知觉能力；负趋地性试验和平面翻正试验检测仔鼠运动能力。
（3）神经发育相关的树突棘损伤分析：高尔基染色（Golgi-cox）分析海马组织树突棘形态；透射电子显微镜观察海马组织突触超微结构PSD形态；膜片钳电生理系统记录海马组织长时程增强（LTP）和最小兴奋性突触后电位（mEPSC）分析树突棘功能。
（4）树突棘相关通路表达分析：qPCR检测通路相关基因表达水平； WB和IF检测通路相关蛋白表达水平及空间定位情况。
（5）大鼠脑立体定位后机制分析：通过脑立体定位技术微量注射Snk-SPAR通路激动剂或抑制剂以及重组胰岛素样生长因子1（IGF-1）于大鼠海马CA1区后，观察小分子多酚对重金属致神经发育障碍、树突棘等指标改变的影响。
5、研究进度安排
第一年（2020.07－2021.06）：建立动物和细胞模型，采用神经行为功能检测、HE染色以及CCK-8细胞活力检测，阐明小分子多酚对重金属铅、镉、砷和汞联合暴露所致神经发育障碍的干预作用。并采用膜片钳电生理系统、共聚焦显微技术、透射电子显微镜技术、活细胞成像树突棘动态观察法以及高尔基染色方法分析小分子多酚对重金属铅、镉、砷和汞联合暴露所致树突棘损害的干预作用。
第二年（2021.07－2022.07）：在整体动物和细胞水平上，免疫荧光、qPCR以及Western blot技术探索小分子多酚对重金属铅、镉、砷和汞联合暴露所致树突棘损害及神经发育障碍干预作用的可能机制通路。并通过质粒构建和细胞脂质体转染技术以及大鼠脑立体定位技术，证实小分子多酚对重金属铅、镉、砷和汞联合暴露所致树突棘损害的干预作用的分子机制。整理分析实验数据，撰写拟发表论文、研究报告和结题报告。
6、项目组成员分工
项目团队负责人熊瑶负责组织整个项目的申报、实施以及结题，并主要负责动物和细胞相关实验；项目团队成员王菲凡主要负责细胞以及分子实验；成员周妮主要负责动物建模以及形态学分析；成员洪涵旭主要负责动物建模以及电生理分析。