1）国家自然科学基金    No. 81760117  项目负责人

《PEBP4对肝纤维化的影响及机制研究》

2）国家自然科学基金    No. 81460126  项目负责人

《基于RAAS, Lipoxin抗肝纤维化机制研究》

3）国家自然科学基金    No. 81100299  项目负责人

(一)项目研究背景

肝损伤是许多肝病的重要病理生理过程，各种病因引起的肝损伤以肝细胞变性坏死/凋亡、炎性细胞浸润、氧化应激反应为主^[1]。我国是肝病大国，乙型肝炎和丙型肝炎分别影响着9000万人和1000万人，同时非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝分别至少影响着1.73亿人和6200万人 ^[2]。与1990年相比，中国2016年乙型肝炎引起的肝硬化及其他慢性肝病患病和死亡人数分别增加了79.6%和2.4% ^[3]。由此可见，肝病所引起的疾病负担有上升趋势，且各型肝病引起的肝损伤最终导致肝衰竭、肝硬化或肝癌的患病率不容忽视。因此，进一步明确肝损伤的发病机理，寻求更合理的干预靶点和治疗方案，从而改善肝病转归，具有重要意义。

枯否细胞（kupffer cells）是肝脏中的巨噬细胞，肝损伤共同的突出特征是枯否细胞大量增加 ^[4]。枯否细胞在受到各种致病因素的刺激时会分泌大量细胞因子，而细胞因子的分泌受核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)调控 ^[5]。大量文献已证实，NF-κB在各类肝损伤的发生发展过程中扮演着重要角色。NF-κB对肝损伤的发生发展过程的影响既表现在NF-κB可以介导TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子生成又表现在细胞因子又可以反过来作用于NF-κB，引发瀑布式炎症连锁反应，最终导致肝损伤 ^[6]。Toll样受体4 (Toll-like receptor 4，TLR4)是存在于枯否细胞的跨膜受体，是“危险信号”的感受器，其天然配体是LPS，当受体激活时能促进枯否细胞向M1型转化从而参与肝脏组织的固有免疫应答和炎症反应 ^{[7, 8]}。而NF-κB是位于TLR4信号通路枢纽位置的核转录因子，NF-κB转位入核后启动靶基因表达并产生相应效应，大量细胞因子分泌，引起炎症反应，从而造成肝损伤。TLR4/NF-κB信号轴如图1所示^[9]。最新研究报道，TLR4过度表达和活化在酒精性和非酒精性肝炎、缺血再灌注性肝损伤、内毒素性肝损伤等过程中均发挥关键作用^[10]。由此可见，TLR4/NF-κB信号轴是肝损伤药物防治的理想靶点之一。

图 1 ARABIC 1 TLR4/NF-κB信号轴

磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine binding proteins，PEBPs）是一类非常保守的蛋白家族^[11]。哺乳类细胞有PEBP1-4四个成员。PEBP1主要高表达于甲状腺、肾上腺和大脑^{[12, 13]}；PEBP2主要表达于睾丸组织^[14]；PEBP3的研究相对较少，功能尚不清楚；而PEBP4在机体各器官均有表达，在细胞膜的合成、肌细胞分化、神经发育、肿瘤发生发展等过程中发挥重要作用^[15]。目前国内外对PEBP4的研究主要集中于探讨其在肿瘤，提示PEBP4在肿瘤的发展过程中发挥重要作用 ^[15]。最新文献报道PEBP4是一种分泌型蛋白^[16]。分泌型蛋白在细胞内具备一定功能，同时在细胞外也可以发挥其生物学效应。PEBP4是分泌型蛋白，这一研究结果提示PEBP4是多功能蛋白，PEBP4必定还具备其它生物学功能。

新近报道，正常肝脏组织PEBP4的表达水平很低甚至不表达，而肝癌发生时PEBP4则呈现高表达状态，最重要的是，PEBP4的表达水平与肝癌预后密切相关^[17]，提示PEBP4可能参与肝脏疾病的发生发展。同时，指导老师实验室的预实验结果提示：PEBP4缺陷型小鼠相对野生型小鼠，肝损伤程度更严重。在此基础上，本项目组推测：NF-κB信号通路是PEBP4护肝效应的重要途径之一。为此本项目拟从整体水平研究PEBP4对肝损伤的影响并确定其主要作用途径和作用靶点，为肝损伤的防治提供新的思路和理论依据。

(二)项目研究目标及主要内容

【研究目标】

1）明确PEBP4在急性肝损伤中的作用。

2）探明PEBP4是否通过TLR4/NF-κB信号轴介导其抗肝损伤效应。

【研究内容】

(三)项目创新特色概述

1)本项目基于指导老师的前期研究基础，结合最新研究资料和预实验结果，首次探索PEBP4在肝损伤中的作用，为肝损伤防治开拓了新的思路。

2)目前PEBP4的研究相对较少，而且主要集中于PEBP4在肿瘤中的作用。在PEBP4是一种分泌型蛋白这一观点被证实后，提示PEBP4一定还具备其它生物学效应。本课题组在预实验结果的基础上，探寻PEBP4在肝损伤中的作用，是对PEBP4功能的拓展，为PEBP4功能研究提供新的实验依据和理论基础。

参考文献

[1]Yan, D., et al., BML-111 Protected LPS/D-GalN-Induced Acute Liver Injury in Rats. Int J Mol Sci, 2016. 17(7).

[2]Xiao, J., et al., Global liver disease burdens and research trends: Analysis from a Chinese perspective. J Hepatol, 2019. 71(1): p. 212-221.

[3]张露,范志芳,刘殿武,周脉耕,王卓群,李曼.1990－2016年中国乙型肝炎引起的肝硬化及其他慢性肝病疾病负担变化趋势分析[J].中华流行病学杂志,2020(02):173-174-175-176-177.

[4]白杨与杨勇, 肝脏相关巨噬细胞起源及发育分化研究进展. 药学研究, 2018. 37(01): 第50-52+59页.

[5]Peng, Z., et al., Hepatoprotective effect of quercetin against LPS/d-GalN induced acute liver injury in mice by inhibiting the IKK/NF-kappaB and MAPK signal pathways. Int Immunopharmacol, 2017. 52: p. 281-289.

[6]Kayagaki, N., et al., Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science, 2013. 341(6151): p. 1246-9.

[7]Tacke, F. and H.W. Zimmermann, Macrophage heterogeneity in liver injury and fibrosis. J Hepatol, 2014. 60(5): p. 1090-6.

[8]Kesar, V. and J.A. Odin, Toll-like receptors and liver disease. Liver Int, 2014. 34(2): p. 184-96.

[9]Kayagaki, N., et al., Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science, 2013. 341(6151): p. 1246-9.

[10]Miura, K. and H. Ohnishi, Role of gut microbiota and Toll-like receptors in nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol, 2014. 20(23): p. 7381-91.

[11]Al-Mulla, F., et al., RKIP: much more than Raf kinase inhibitory protein. J Cell Physiol, 2013. 228(8): p. 1688-702.

[12]Katada, E., et al., Distribution of hippocampal cholinergic neurostimulating peptide (HCNP)-like immunoreactivity in organs and tissues of young Wistar rats. Histochem Cell Biol, 1996. 105(1): p. 43-51.

[13]Frayne, J., et al., Localisation of phosphatidylethanolamine-binding protein in the brain and other tissues of the rat. Cell Tissue Res, 1999. 298(3): p. 415-23.

[14]Hickox, D.M., et al., Identification of a novel testis-specific member of the phosphatidylethanolamine  binding protein family, pebp-2. Biol Reprod, 2002. 67(3): p. 917-27.

[15]Wang, X., et al., A novel human phosphatidylethanolamine-binding protein resists tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis by inhibiting mitogen-activated protein kinase pathway activation and phosphatidylethanolamine externalization. J Biol Chem, 2004. 279(44): p. 45855-64.

[16]He, H., et al., Phosphatidylethanolamine binding protein 4 (PEBP4) is a secreted protein and has  multiple functions. Biochim Biophys Acta, 2016. 1863(7 Pt A): p. 1682-9.

(四)项目研究技术路线

【研究技术路线】

1)项目组具备良好的前期工作基础，技术切实可行。项目指导老师已经主持完成了3项国家自然科学基金（No. 81100299，81460126，81100299），集中研究了肝纤维化的防治策略。在No. 81100299 、No. 81460126和No. 81100299项目的资助下，课题组探讨了脂氧素、Lipoxin对肝纤维化的影响，并从RAAS角度阐明了脂氧素抗肝纤维化的新机制，这三个项目均已按时结题。

2)本项目组团队成员均为临床医学本科学生，掌握多种实验技术，熟悉多门基础医学课程知识，同时具有一定的科研精神、创新意识和团队责任感，具备完成科研任务的能力。

3)随着对肝损伤机制研究的深入，枯否细胞（肝脏巨噬细胞）活化已被公认为肝损伤形成的关键环节。因此，将巨噬细胞作为研究切入点，具有很高的可行性。

4)本项目组指导老师从事肝脏疾病防治策略的研究多年，先后参加多项国家级和省部级课题，近年来在SCI收录杂志上发表相关论著多篇。本项目组在肝损伤模型建立及相关指标检测方面具有丰富经验，为本项目的完成奠定了良好的理论、技术和人员支撑。同时，本实验室及学院开放实验室提供了理想的实验平台。

(五)研究进度安排

2020.06-2020.08 查阅文献、搜集相关资料、完善课题设计；

2020.09-2021.01 学习和掌握本课题所需的实验方法；

2021.02-2022.01 完成实验操作；

2022.02-2022.06 阶段性总结，完善研究内容，并根据需要补充实验。整理和统计实验资料，论文撰写、发表与结题。

(六)项目组成员分工

白梁宇（负责人）：负责部份实验操作，实验设计及管理，论文撰写与发表。

郑志涛：负责部分实验操作，复制动物模型，采购试剂。

1)指导老师周晓燕副教授的课题组先后承担多项国家自然科学基金及省部级课题，为本课题的顺利完成提供了人员和技术支撑。

1)明确PEBP4在急性肝损伤形成过程中的作用，为急性肝损伤的防治提供实验依据。

本课题旨在探究PEBP4在LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤中的作用和机制。实验结果如下：WT小鼠被LPS/D-GalN处理后PEBP4表达下调。 PEBP4 被特异性敲除后，小鼠肝损伤加重，肝功能受抑制，表现为肝细胞水肿、炎症细胞浸润、AST/ALT活性升高。肝脏炎症反应增强表现为中性粒细胞浸润、细胞因子（如IL-1β、TNF-α、IL-10）分泌增加。此外，实验结果表明，PEBP4 被特异性敲除后Toll样受体4 （Toll-like receptor 4，TLR4)、p-IκB-α、核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)表达上调，而胞质IκB-α和NF-κB p65表达下调。综上所述，PEBP4对LPS/D-GalN诱导的ALI有保护作用，其作用部分通过抑制TLR 4/NF-κB介导的信号通路实现。