项目申请人来自医学检验技术专业18级学生，经过两年学习，所学专业课知识基本掌握，热爱科研。团队的所有成员都有过科研经验，曾经跟随老师完成过课题研究，感情基础深厚并有着吃苦耐劳的团体精神，专业学习成绩突出，且掌握了一定的其他专业学科知识和其他相关知识，此次为了参加“大学生创新创业训练计划”做了充分的准备工作。

2.1.1国内外研究现状

表1. 目前病毒检测方法的局限性^[1]

以免疫荧光技术和qPCR技术为例。免疫荧光技术可用于鉴定病毒抗原，目前被广泛应用于临床样本病毒感染的快速检测[2-5]。免疫荧光染色通常被认为是一种快速（1-2h）、灵敏度高且比较特异的病毒鉴定手段。但是，免疫荧光检测并不能鉴别所有的病毒毒株，比如肠道病毒，因为大部分肠道病毒的单克隆抗体敏感性差，跟鼻病毒发生交叉反应的情况非常普遍[6]。另外，由于一些商品化抗体的特异性不够理想，发生非特异结合或交叉反应，也会导致结果出现一些误差。

用分子技术从临床样本中直接对病毒基因组进行鉴定是21世纪的重大发现之一。核酸扩增技术包括PCR、基于核酸序列的扩增和劳伦斯利弗莫尔微生物检测阵列等都无疑是快速检测和鉴定大多数已知人类病毒的领先技术。PCR可以在体外将DNA序列的一段特定区域扩增106倍，因此是一种非常灵敏的检测手段。PCR还可以用于病毒RNA的鉴定，只需先将RNA逆转录成DNA，然后再进行PCR分析，这一方法被称之为逆转录PCR（RT-PCR）。自从Zhang和Evans 在1991年首次报道以来，陆续有人报道用RT-PCR方法进行流感病毒的鉴定[7]。

而自从2019年12月以来，COVID-19疫情极大地威胁了人类的生命安全，干扰了人们的正常生活。在疫情发展早期，新冠病毒的检测灵敏度和耗费的时间，是疫情难以控制的重要因素，传统核酸试剂盒正是基于PCR的检测方法，存在耗时长、价格昂贵等问题。
如上所述，传统病毒检测方法具有各自的局限性，因此需要开发高灵敏度的生物传感器，以实现对病毒的高灵敏度、高性价比的快速检测。近年来，各种用于病毒基因直接检测的生物传感器被开发出来，包括硅纳米线型场效应晶体[8]、金纳米颗粒型基因组芯片[9]、阻抗传感器[10]和磁电化学阵列[11]等。这些生物传感器是基于目标病毒核酸与固定在生物传感器衬底上的寡核苷酸探针的杂交，在没有扩增的情况下，可以为病毒检测提供快速响应和超敏性。

福斯特共振能量转移(Förster resonance energy transfer, FRET)是一种直接、灵敏的技术，在生物检测、生物传感、生物成像和光动力治疗等领域有着广泛的应用[12-14]。荧光生物传感器一般由荧光供体和荧光受体组成，可分为分子间型和分子内型[15,16]。传统的荧光团包括FAM、Texas red、Cy5，它们受到价格昂贵和易光漂白的限制。因此，它们不适合开发可靠、低成本的生物传感器。众所周知，镧系上转换纳米粒子(UCNPs)可以将低能量近红外(NIR)光子转化为可见光，其方法是连续吸收多个光子并进行能量转移，即发光共振能量转移(LRET)[17]。此外，UCNPs因其光稳定性、低毒、生物相容性等优点引起了人们的极大兴趣[18-21]。
基于上转换纳米材料检测的核心是探针在与靶向物结合前后具有不同的能量转移效率。通常，为了在检测中触发LRET过程，能量受体应满足两个条件：（1）受体的吸收带应与UCNPs的发射带有重叠，重叠的程度越高，受体发光强度越强，生物传感器的灵敏度相对越高；（2）受体与UCNPs的距离符合LRET的范围，通常为2-10nm内。所以，可以通过调整UCNPs和受体之间的光谱重叠和距离来调节LRET的效率。近年来，基于上转换荧光性质，研究者们针对温度、离子、小分子、DNA、酶、病毒等生物信息检测开展了许多研究。

在温度检测领域，Vetrone等[22]使用NaYF4∶Yb3+,Er3+作为纳米温度计感测活Hela细胞进行温度；Uchiyama等[23]也设计了一种光致发光聚合物温度计,可用于检测细胞内20~50 ℃范围内的温度变化；Brites等[24]提出一种基于上转换纳米材料的温度传感技术，用于测量悬浮在水溶剂和有机溶剂中的布朗纳米晶体的瞬时速度，他们发现热平衡下NaYF4∶Yb,Er纳米晶具有出色的热敏性(1.15%K1@296 K)和高空间分辨率(<11m)；李富友课题组[25]合成了六方相的 NaYF4∶Yb3+,Er3+和NaYF4:Yb3+,Nd3+，使用meso-2,3-二巯基琥珀酸进行表面修饰后应用于细胞温度传感及成像，他们证明这两个发射峰的强度比与NIH-3T3细胞的内部或外部温度的倒数之间存在良好的对数关系，并通过加热-冷却循环的温度依赖性光谱证明了探针材料具有良好的热稳定性。

上转换纳米粒子也被用于无机离子的检测。2017年，Yao课题组[26]研制出一种新的基于UCNPs的Ag+传感器，当在水溶液中混合Ag+、UCNPs探针和邻苯二胺(OPD)时，有效地淬灭UCNPs的发射；Ag+可以在0~0.5×10-3 mol/L的范围内被定量检测，检测下限为3.3×10-8 mol/L；Zhu课题组[27]利用氨基标记的单链DNA对UCNP进行功能化，使用石墨烯量子点(GQDs)作为能量受体，从而制备Ag+传感器，其检测下限为60pmol/L；Liu课题组[28]开发了一种上转换纳米探针用于Ca2+的高效检测，该探针在核-内壳-外壳结构的表面上修饰能量转移受体，加入Ca2+后受体猝灭，而稀土离子发光中心的发光性能逐渐恢复，其检测下限可达15pmol/L。此外，Fe2+、Zn2+、Cu2+等金属离子也被UCNPs传感器检测[29-35]。

上转换纳米粒子生物传感器也能对O2、CO2和NH3分子进行检测。Wolfbeis课题组[36]首先报道了使用基于UCNP的铱络合物探针来检测O2的含量；Zhao课题组[37]研究出一种含有磷光铱络合物的纳米探针,可以同步利用下转换和上转换荧光来监测O2浓度；Shi课题组[38]对基于UCNP的氧气探针进行了深入研究，实现了体外和体内可逆检测氧水平的目标；Lannutti课题组[39]研制出一种具有核-壳纤维结构和以相同钌络合物作为能量受体的O2探针；Li课题组[40,41]报告了一种基于UCNP的NO探针，可用于检测生物液体、活细胞和组织中的NO。

UCNPs生物传感器也被应用于免疫检测，例如，Kuningas等[42]使用17β-雌二醇结合的Oyster-556染料作为能量受体，17β-雌二醇抗体Fab片段修饰La2O2S∶Yb,Er，检测血清中的17β-雌二醇，在缓冲液和血清中检出的极限值分别为0.4 nmol/L和0.9 nmol/L；Wang等[43]利用Au纳米粒子作为能量受体，设计了一种基于LRET的上转换免疫传感器，用于检测山羊抗人免疫球蛋白G(IgG)，其检测下限低至0.88 μg/mL；Kim等[44]也开发了一种基于LRET的免疫传感器，通过淬灭NaYF4:Yb,Er纳米颗粒的发光信号，来检测糖化血红蛋白(HbA1c)的平均水平；Jiang等[45]构建的LRET传感器是将PAA包覆的NaYF4∶Yb,Er纳米颗粒作为能量供体、碳纳米颗粒作为能量受体，能够在0.5~80 ng/mL范围内定量检测人血清中的免疫球蛋白E(IgE)。

基于UCNPs的核酸检测传感器也被广泛研究，例如，李富友课题组[46]将能与靶向DNA特异性识别的ssDNA探针偶联到NaYF4:Yb,Er纳米颗粒作为能量供体，以另一部分靶向互补的ssDNA修饰TAMRA荧光团作为能量受体，设计了检测DNA的上转换纳米探针，检测下限达到了nmol/L的水平；Krull课题组[47]同样使用探针分子ssDNA修饰NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4纳米颗粒作为能量供体，以ssDNA修饰的QD作为能量受体，靶向DNA用于连接探针寡核苷酸和检测寡核苷酸，供体-受体的距离可调节，这种传感器在3分钟内即可对90%血清样品中完成HPRT1靶标的测定；Wang课题组[48]设计了UCNPs核-壳-壳纳米结构，在808nm激发光的作用下，在远红外(660 nm)光谱区域显示出主要的发射，实现了5.4nmol/L的检测下限，探针可以在组织包裹的情况下灵敏地检测癌细胞；2016年，Kuang课题组[49]报道了采用由金和上转换纳米粒子自组装的手性等离子纳米锥体在活细胞中进行microRNA超敏感定量的双模策略；Zhao等[50]设计了一个DNA合成纳米设备，以上转换发光激活的方式检测活细胞中的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)。

尽管稀土上转换生物传感器的研究非常广泛，但是在病毒检测领域的研发仍较少。Hao课题组[51]开发了一种基于发光共振能量转移过程，UCNPs与金纳米颗粒连接快速灵敏地检测H7亚型的生物传感器，并设计了一种含有UCNPs的探针和纳米孔膜结合的异质平台[52]，用于超灵敏检测埃博拉病毒寡核苷酸。但是，其检测方法只适用于理想，需要将病毒基因片段修饰到纳米金颗粒上，限制了其实用性。

2.1.2 研究意义
    众所周知，病毒的传播会给人类及其它生物引发许多重要的传染病，其中包括SARS、COVID-19、流感、狂犬病、麻疹、多种形式的腹泻、肝炎、登革热、黄热病、脊髓灰质炎、天花和艾滋病[53]。有些病毒，即致癌病毒，会导致某些癌症的发展。因此，病毒的检测至关重要。现阶段，最常用的病毒定量检测方法包括免疫荧光、实时定量多聚酶链反应（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和血凝试验等等。但大多存在重复性差、灵敏度低、耗时长且昂贵等缺点。近几年，纳米技术的引入赋予了生物传感许多新的特性，如高灵敏、多参数、微环境应用等[54]。构建纳米生物传感器，或与纳米材料相结合构建杂合纳米生物传感器，特别适合于细胞中生物学过程和重大疾病发生发展过程的研究。本项目拟采用核酸探针结合上转换纳米发光材料-石墨烯量子点体系，利用发光共振能量转移原理，信号强度随病毒浓度变化，能够极大提高检测的灵敏度，实现病毒检测的可视化。核酸探针序列和结构可调控，可潜在实现多种病毒的检测，进而发展成为一类普适性的病毒早期检测用生物传感器开发途径和方法。

2.1.3项目已有的基础、与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
本项目将在南昌大学医学部公共卫生学院郝先教授和预防医学实验教学中心杨一飞老师的指导下完成。郝先教授是医学部引进的高层次人才，并获得江西省“双千计划”资助，发表高水平SCI论文24篇，申请专利6项，并获得吉林省科技进步奖1项。现在主要从事生物传感器的研发等，已于2019年成立生物传感器实验室，正在进行基于上转换发光纳米材料的生物传感器的研发。杨一飞老师发表SCI论文10篇，获得吉林省科技进步三等奖1项，申请并获权专利3项。杨一飞老师在前期进行了上转换纳米发光材料的合成及药物释放（Eur. J. Inorg. Chem. 2010, 33, 5195–5199） 。对纳米材料的合成及修饰具有良好的背景，将为本项目的顺利施行，创造一个良好的开端以及提供有力的技术保障。

2.1.4已具备的条件，尚缺少的条件及方法等
本项目将依托南昌大学医学部公共卫生学院的单分子检测与传感实验室，实验室现有生化实验室、化学实验室、细胞培养室、PCR、荧光显微镜、原子力显微镜等设备。南昌大学大型仪器共享平台有项目所需的透射电镜、扫描电镜、X射线衍射、傅里叶红外、紫外/可见光谱仪、荧光光谱仪、共聚焦显微镜等大型仪器。因此，具备项目所需的基本条件。
当前本项目尚缺少部分实验材料、试剂及测试费用等，盼望得到资助购买。

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2、项目研究目标及主要内容

2.2.1 项目研究目标
针对现有病毒检测技术存在的局限性，本项目拟研究开发一类基于上转换发光纳米材料与石墨烯量子点的病毒检测用生物探针，结合纳米发光材料的优势及核酸探针的特异性，进行病毒检测的创新性方法学研究，对EV71病毒进行高灵敏度、高特异性检测。经过一年研究，将实现以下科学研究目标：
(1) 开发基于纳米发光材料与核酸探针的生物探针，设计不同核酸探针结构，实现病毒检测特异性，并能准确定量检测病毒，进而达到检测超痕量病毒样品 。
(2) 开发一类潜在通用的病毒检测方法，只需改变不同的核酸探针序列，即可检测不同病毒 的方法。
2.2.2 主要研究内容
本项目拟通过核酸探针与纳米发光材料相结合，研究开发高灵敏度、便携式的病毒检测用生物探针，创建一种基于上转换纳米发光材料和石墨烯量子点的病毒检测方法，具体将开展如下内容研究：
(1) 高量子产率上转换纳米发光材料的合成及生物亲和性修饰。在本项目中，上转换纳米发光材料是生物传感器研发的重心，因此拟采用两种方法（直接法和间接法）来制备具有生物亲和性的上转换纳米发光材料。而高量子产率的上转换纳米发光材料是提高传感器检测灵敏度的关键之一，基于文献报道，本项目拟制备六方相NaYF4稀土离子掺杂的核壳结构上转换纳米发光材料。并通过控制Yb3+和Er3+等稀土离子的掺杂浓度，实现可调谐的发射颜色，从而优化发光能量共振转移。 
1) 水热反应一步法合成氨基末端的枝状PEI包覆的上转换纳米发光材料，调整配体比例和稀土离子掺杂浓度，以获得最佳发光强度和最佳发光波长；并利用醛基与氨基之间的共价反应，偶联核酸探针。
2) 溶剂热共沉积法合成油酸包覆的上转换纳米发光材料，调整配体比例和稀土离子掺杂浓度，以获得最佳发光强度和最佳发光波长；然后通过配体交换，进行生物亲和性修饰羧基末端的PAA，利用羧基与核酸探针末端氨基进行反应形成酰胺键，偶联核酸探针。

(2) 石墨烯量子点的制备与表面修饰。首先将氧化石墨烯在真空状态下通过高温还原成石墨烯纳米片；在浓硫酸和浓硝酸中氧化并切割石墨烯纳米片；最后将氧化后的石墨烯纳米片在溶剂热环境下还原并形成石墨烯量子点。
(3)  生物探针的设计与开发。基于设计与病毒特异性基因片段完全互补的单链核酸探针，通过核酸探针序列的选择和设计，降低错配的可能性，从而保证传感器的检测特异性；通过调控液相体系中的成分、离子强度及pH值等，提高病毒检测的灵敏度。


3、项目创新特色概述
基于各类病毒肆虐全球，对人类社会造成巨大危害，而现有检测方法具有耗时长且大多较为昂贵的局限性，发展快速有效和高灵敏度的检测方法至关重要。本项目拟采用核酸探针结合上转换纳米发光材料-石墨烯量子点体系，利用发光共振能量转移原理，实现检测病毒信号从0到1，能够极大提高检测的灵敏度，并实现病毒检测的可视化。本项目中核酸探针序列和结构可调控，因此，可潜在实现多种病毒的检测，进而发展成为一种普适性的病毒检测用生物探针开发途径和方法。开展对这种超高灵敏度生物传感器的研发和方法学的探讨为本项目突出的研究特色。

4、项目研究技术路线
(1) 上转换纳米发光材料合成及表面生物改性，拟采用两种方式：直接法与间接法。直接法是用高温水相一步法合成具有生物亲和性的上转换纳米材料；间接法是用高温溶剂热反应生成油酸包覆的上转换纳米发光材料，再对其进行相转移及生物亲和性修饰。前者具有制备方法简单快捷，后者具有纳米材料形貌、粒径均一，可调控等优点。
(2) 在构建更加简便快捷的上转换纳米发光材料-石墨烯量子点体系生物探针。对上转换纳米发光材料进行核酸探针修饰，而该核酸探针与病毒基因碱基互补配对，再加入石墨烯，形成稳定的没有发光现象的生物传感器体系。当加入病毒基因时，与传感器中核酸探针杂交，上转换纳米发光材料连同核酸探针从石墨烯表面脱附，从而上转换纳米发光材料恢复发光，且随着病毒量的增加，发光强度增强。

5、研究进度安排
(1) 2020年8月-2021年6月，核酸探针设计，上转换纳米发光材料合成及条件优化；石墨烯量子点的合成。 (2) 2021年7月-2022年7月，以EV-A71病毒为例，进行生物探针的开发，并进行检测，特异性、灵敏度、线性范围、检测限等分析；完成项目。

6、项目组成员分工
李玉青，项目负责人，并主要负责上转换纳米材料合成与修饰；
胡佳翌，核酸探针合成及纯化；
姚婕，探针与上转换纳米材料连接；
陈晶，石墨烯量子点合成方法优化；
王淏， EV71病毒核酸序列的检测，并分析生物探针性能。

1、开发一种基于上转换纳米发光粒子NaYF₄:Er³⁺/Yb³⁺与石墨烯量子点之间发光能量共振体系的生物探针，能够定量的检测目标物；

①合成了具有纳米材料形貌、粒径均一，可调控的UCNPs。

因水热反应合成UCNPs形貌差、尺寸不均一，所以改用高温溶剂热反应生成油酸包覆的上转换纳米发光材料，再对其进行相转移及生物亲和性修饰，调整配体比例和稀土离子掺杂浓度，以获得最佳发光强度和最佳发光波长。

②完成了核酸探针的设计及纳米材料和核酸探针的偶联。

对上转换纳米发光材料进行核酸探针修饰，通过配体交换，进行生物亲和性修饰羧基末端的PAA，利用羧基与核酸探针末端氨基进行反应形成酰胺键，偶联核酸探针。

③完成了基于氧化石墨烯的液相生物传感体系的制备。

因为石墨烯量子点合成后，性能不够稳定，作为生物传感器中的荧光淬灭剂而言效果不理想，因此改用了氧化石墨烯。在核酸探针与病毒基因碱基互补配对之后，再加入石墨烯，形成稳定的没有发光现象的生物传感器体系。

众所周知，病毒的传播会给人类及其它生物引发许多重要的传染病，其中包括SARS、COVID-19、流感、狂犬病、麻疹、多种形式的腹泻、肝炎、登革热、黄热病、脊髓灰质炎、天花和艾滋病。有些病毒，即致癌病毒，会导致某些癌症的发展。因此，病毒的检测至关重要。现阶段，最常用的病毒定量检测方法包括免疫荧光、实时定量多聚酶链反应（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和血凝试验等等。但大多存在重复性差、灵敏度低、耗时长且昂贵等缺点。近几年，纳米技术的引入赋予了生物传感许多新的特性，如高灵敏、多参数、微环境应用等。构建纳米生物传感器，或与纳米材料相结合构建杂合纳米生物传感器，特别适合于细胞中生物学过程和重大疾病发生发展过程的研究。本项目采用核酸探针结合上转换纳米发光材料-石墨烯量子点体系，利用发光共振能量转移原理，信号强度随病毒浓度变化，能够极大提高检测的灵敏度，实现病毒检测的可视化。核酸探针序列和结构可调控，可潜在实现多种病毒的检测，进而发展成为一类普适性的病毒早期检测用生物传感器开发途径和方法。

透过对实验现象的观察、分析和测量，使我们进一步加深了对医学原理的理解，培养与提高了我们的科学实验潜力以及科学实验素养。对于我们这样的医学生，仅有扎实的科学理论知识是远远不够的，科学实验是科学理论的源泉，是自然科学的根本，也是医疗技术的基础。一个合格的医疗人员除了要具备较为深广的理论知识，更要具有较强的实践经验，项目实验为我们带给了这样的一个平台，为我们动手潜力的培养奠定了坚实的基础。古往今来，任何科研无一不是经过实验的验证的，也可以说，实验是检验理论的唯一标准。作为一个大学生，我们决不能容忍自己死读书，读死书，只是在理论上去分析而缺乏实践。我们相信：只要我们肯动手动脑，再辅之以勤奋和坚持，必能不断提高我们的实干能力，必能不断的创新，为我国的医学事业发展与进步贡献出自己的一份力量。最后，再次感谢指导老师们，研究生师兄师姐们和学长学姐的耐心帮助和悉心指导，让我们在完成项目任务之余感受到了更多人情温暖，他们才是让本次创新创业项目顺利完成的最重要保障。